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本文摘要

擴散屏障法是一種通過最小化測量過程的影響來可靠地測量蛋白質電泳遷移率的方法。蛋白質與施加電場所用的電極接觸會導致樣品發(fā)生變性和聚集，導致Zeta電位明顯變化。本文記錄Zetasizer納米粒度電位儀利用擴散屏障法將樣品分子與電極分離，可以很好地避免電極接觸對蛋白質測量的影響。

擴散屏障法簡介

開發(fā)基于蛋白質的產(chǎn)品需要了解它們在溶液中的表現(xiàn)，而測量樣品的Zeta電位可通過預測聚集行為，研究蛋白質制劑的穩(wěn)定性。但在實際測量過程中，Zeta電位明顯變化并不是電場本身導致了蛋白質的聚集，其變化的真正原因是蛋白質與電極的接觸導致。

本文將介紹一種新的方法：擴散屏障法，可以提高測量樣品Zeta電位時的準確性和可重復性。

擴散屏障法通過引入一個較小的樣品量，用溶解蛋白質的相同緩沖液將樣品與電極分離，因此電極對蛋白質的影響大大降低。由于這種保護僅由樣品與電極的距離提供，在樣品擴散到電極之前，樣品都不會受其影響。而這一過程可能需要數(shù)小時，因為只測量了可溶性天然蛋白的遷移率，使得樣品的測量結果更加可靠。

測量過程

一、樣品裝載

首先將溶解蛋白質的緩沖液注入折疊毛細管樣品池中。然后將樣品池放入Zetasizer納米粒度電位儀中靜置2至3分鐘，使其溫度達到平衡。這將減少任何與溫度有關的流體運動，如對流。然后取出樣品池，通過圖1所示的槍頭將20~100 μL的樣品直接注入毛細管樣品池的最底部（圖2）。

圖 1 200μl的凝膠上樣移液槍頭

圖2 折疊毛細管孔中的凝膠移液槍頭，用于裝載擴散屏障方法的樣品量

圖3 裝樣對比圖：在10 mM NaCl中完全充滿藍色葡聚糖的樣品池（左）；樣品池填充10 mM NaCl，并加入50 μl藍色葡聚糖作為擴散屏障（右）

很明顯，樣品的藍色部分位于樣品池的測量體積中，距離樣品池頂部的電極有相當大的距離。如果樣品池保持直立并小心處理，樣品將不會在樣品池內(nèi)部擴散。在開始測量之前，應使溫度達到平衡。

二、遷移率測量

理論上，使用擴散屏障法進行遷移率測量與在Zetasizer Nano中進行常規(guī)測量完全相同。在實際測樣過程中，離子強度較高的緩沖液會有較高的電導率，導致在給定電壓下焦耳加熱增加。需要進行一些手動改進，以提高使用擴散屏障法進行測量的數(shù)據(jù)質量。

為了避免顯著的焦耳熱，應根據(jù)所使用的緩沖液的導電性來選擇電壓。如表1所示，在軟件中自動選擇適當?shù)碾妷海S著緩沖鹽的濃度增加，所用的電壓降低，并且運行次數(shù)最多為20次，以盡量減少焦耳熱。建議在兩次測量之間設置180秒的延遲，這也是為了確保測量之間的溫度平衡。

表1：給定濃度緩沖液的建議電壓和最大運行次數(shù)

Zetasizer軟件版本7及以上的蛋白質遷移率測量類型將使所有這些設置自動化，使測量盡可能簡單。

評估數(shù)據(jù)質量

一，粒徑分布變化

建議在zeta電位測量之前和之后都進行粒徑測量，以檢查樣品是否因電位測量而發(fā)生變化。如果遷移率測量影響了樣品并導致其聚集，這些聚集應該出現(xiàn)在遷移率測量后的尺寸測量數(shù)據(jù)中。圖4A顯示了在任何遷移率測量之前的粒徑測量示例。該樣本不含聚集體，PDI為0.05。在常規(guī)的zeta電位測量后，聚集體已經(jīng)形成，PDI接近0.2（圖4B）。然而，當采用擴散屏障法時，沒有形成聚集體，遷移率測量后的PDI仍然低于0.05（圖4C）。

圖4A 樣品遷移率測量前的粒徑分布

圖4B 樣品常規(guī)遷移率測量后的粒徑分布

圖4C 使用擴散屏障法測量遷移率后的粒徑分布

二、頻率分布的對比

樣品中的聚集體將具有較低的布朗運動速度，從而在頻率圖中產(chǎn)生一個尖銳的峰值。因此，頻率圖中出現(xiàn)寬峰是識別高質量數(shù)據(jù)的好方法。

圖5顯示了蛋白質遷移率測量的兩個頻率圖。圖5A顯示了使用擴散屏障法重復測量的頻率寬峰，連續(xù)測量的圖重疊良好，表明沒有聚集物存在。圖5B顯示了未使用擴散屏障法的連續(xù)測量疊加圖。第一個測量是紅線，它顯示了廣泛的分布和良好的測量。然而，隨著測量的進行，由綠藍線和黑線表示，很明顯，一個大而尖銳的峰正在形成，這代表了在測量過程中聚集的樣品。多次測量的圖不一致，因此無法獲得可重復的遷移率測量。

圖5A 使用擴散屏障法進行的連續(xù)測量的頻率圖

圖5B：常規(guī)遷移率測量的頻率圖

焦耳熱是測量重復性下降的原因之一，而通過電導率的測量可以有效識別焦耳熱。為了盡量減少焦耳熱的影響，電導率應限制在連續(xù)測量之間的增加不超過5-10%。如果它的增加超過這個值，則表明已經(jīng)發(fā)生了明顯的加熱，這可能會影響樣品并降低測量的可重復性。

至少要進行5次測量，以確保數(shù)據(jù)是可重復的。在方法開發(fā)過程中，建議測試一種廉價的替代蛋白質，以優(yōu)化方法。

結論

通過應用擴散屏障法，可以有效消除在使用電泳光散射法進行Zeta電位測量時蛋白質樣品和電極的相互作用造成的聚集。通過最小化樣品體積并將蛋白質與電極分離，這種新方法是一種簡單、強大的解決方案，可以在不損害蛋白質本身的情況下對蛋白質的遷移率進行高度可重復的測量。

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