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【熱點(diǎn)應(yīng)用】差示掃描量熱儀在核酸遞送載體LNP/AAV表征中的應(yīng)用

馬爾文帕納科 2023-02-17 | 閱讀：2392

差示掃描量熱儀

在核酸遞送載體LNP/AAV表征中的應(yīng)用

#本文由馬爾文帕納科醫(yī)藥行業(yè)業(yè)務(wù)發(fā)展專(zhuān)家范洋晶供稿

自 2019 年新冠疫情在全球爆發(fā)之后，以 mRNA 為代表的核酸疫苗/藥物受到了廣泛關(guān)注。目前已有多款核酸藥物獲批上市，mRNA 疫苗也成為FDA批準(zhǔn)的首款COVID-19疫苗。在體內(nèi)，核酸容易被免疫系統(tǒng)的細(xì)胞吞噬，并被核酸酶降解，所以需要遞送技術(shù)的配合，將核酸遞送到靶細(xì)胞中。有效的體內(nèi)遞送是核酸疫苗/藥物發(fā)揮療效的關(guān)鍵，目前常用的核酸遞送載體包括病毒載體和非病毒載體。

病毒載體在核酸遞送領(lǐng)域已有較長(zhǎng)歷史，主要有重組腺相關(guān)病毒（rAAV）和慢病毒類(lèi)的病毒產(chǎn)品。脂質(zhì)納米顆粒(Lipid Nanoparticles，LNPs) 主要由可電離陽(yáng)離子脂質(zhì)、膽固醇、中性輔助磷脂和聚乙二醇修飾的磷脂（PEG-脂質(zhì)）組成，是目前遞送 mRNA 最主流的非病毒載體之一。由于其固有的結(jié)構(gòu)復(fù)雜性，在產(chǎn)品開(kāi)發(fā)和過(guò)程控制期間，核酸遞送載體的設(shè)計(jì)、表征和質(zhì)量控制都需要有效的分析工具。

差示掃描量熱法（Differential Scanning Calorimetry, DSC）是在程序控制溫度下，測(cè)量樣品池與參考池之間的功率差與溫度的關(guān)系。MicroCal PEAQ-DSC 微量熱儀是表征蛋白質(zhì)等生物分子熱穩(wěn)定性的強(qiáng)有力的工具，主要用于生物制藥研發(fā)和生產(chǎn)。

MicroCal PEAQ-DSC 系統(tǒng)易于使用，無(wú)需標(biāo)記或固定，既可用于常規(guī)穩(wěn)定性研究，生物相似性和批次間一致性評(píng)價(jià)以及純化和生產(chǎn)條件的優(yōu)化，在核酸遞送載體的生物物理表征中也有很好的表現(xiàn)。

應(yīng)用一

MicroCal PEAQ-DSC表征

mRNA-LNP樣品的熱轉(zhuǎn)變可逆性和重復(fù)性

MicroCal PEAQ-DSC用于分析 mRNA-LNP 以及游離的 mRNA 樣品。使用專(zhuān)用的PEAQ-DSC分析軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，對(duì)樣本的 DSC 熱力學(xué)圖譜進(jìn)行基線校正后，計(jì)算熱轉(zhuǎn)變溫度 Tm 值和熱力學(xué)焓變?chǔ)。

借助 DSC 可以更好地了解 mRNA 和 LNP 的熱力學(xué)轉(zhuǎn)變。

典型的 mRNA 具有與莖環(huán)狀結(jié)構(gòu)展開(kāi)相關(guān)的熱轉(zhuǎn)變，DSC 能夠檢測(cè)出這些不同的峰。如左下圖所示，在不同 pH值下，mRNA-LNP 表現(xiàn)出許多不同且又重疊的熱轉(zhuǎn)變，表觀焓也有明顯差異。DSC能夠分離多個(gè)不同的熱轉(zhuǎn)變峰，而右下圖的圓二色光譜（Circular dichroism, CD）不夠敏感，無(wú)法識(shí)別。

通過(guò)在每次DSC掃描樣品后進(jìn)行重新掃描，對(duì)樣品進(jìn)行熱轉(zhuǎn)變的可逆性測(cè)試。下圖顯示了第一次掃描和重新掃描后的 mRNA-LNP1 和游離 mRNA 樣品的 DSC 圖譜。結(jié)果表明 mRNA-LNP1 樣品的熱轉(zhuǎn)變峰是不可逆的，在重新掃描時(shí)并不會(huì)重現(xiàn)。相反，游離 mRNA 樣品在 65℃ 的熱轉(zhuǎn)變峰顯示出約 40% 的可逆性。

下圖為兩種 LNP配方不同的 mRNA-LNP1和 mRNA-LNP2 的 DSC 熱力學(xué)圖譜，均展示了良好的可重復(fù)性。

應(yīng)用二

MicroCal PEAQ-DSC表征

rAAV5樣品的熱穩(wěn)定性

MicroCal PEAQ-DSC用于分析空的和載有核酸的 rAAV5 樣品的熱穩(wěn)定性，如下圖所示，他們對(duì)熱應(yīng)力表現(xiàn)出不同的響應(yīng)?？盏?rAAV5 樣品似乎更容易發(fā)生熱不穩(wěn)定，并且可以觀察到在主熱轉(zhuǎn)變溫度前的預(yù)過(guò)渡峰。而在載有核酸的 rAAV 樣品的 DSC 圖譜中，可以在 94.7℃ 左右檢測(cè)到一個(gè)額外熱轉(zhuǎn)變峰，這種額外的較高溫度轉(zhuǎn)變與 rAAV5 的血清型特異性 Tm 值明顯不同，可歸因于 rAAV5 衣殼崩解后釋放的核酸分子的結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)變。

結(jié)論

Conclusion

綜合應(yīng)用多種分析技術(shù)對(duì)核酸遞送載體進(jìn)行全面的物理和化學(xué)屬性表征，對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行合理的解釋?zhuān)@對(duì)于指導(dǎo)核酸疫苗/藥物的設(shè)計(jì)，優(yōu)化生產(chǎn)過(guò)程，并確定最終產(chǎn)品的穩(wěn)定性都是非常重要的。

馬爾文帕納科所提供的 MicroCal PEAQ-DSC 儀器能夠非常精準(zhǔn)地評(píng)估 mRNA-LNP 和 rAAV 樣品的熱轉(zhuǎn)變可逆性、重復(fù)性和穩(wěn)定性等，為基于病毒和非病毒載體的新型核酸疫苗/藥物平臺(tái)發(fā)展提供了有力保障。

參考文獻(xiàn)

[1] Markova N, Cairns S, Jankevics-Jones H, et al. Biophysical Characterization of Viral and Lipid-Based Vectors for Vaccines and Therapeutics with Light Scattering and Calorimetric Techniques. Vaccines (Basel). 202; 10(1): 49.

[2] Larsona NR, Hua G, Wei YJ, et al. pH-Dependent Phase Behavior and Stability of Cationic Lipid?mRNA Nanoparticles. J Pharm Sci. 2022; 111(3): 690-698.

相關(guān)產(chǎn)品

PEAQ-DSC 差示掃描量熱儀

新一代的MicroCal PEAQ-DSC系統(tǒng)即使對(duì)于非常稀釋的蛋白溶液，仍能檢測(cè)出微弱的熱量變化，并利用這些信息準(zhǔn)確地表征需要分析的分子的熱穩(wěn)定性。

DSC所提供的熱穩(wěn)定性信息被業(yè)內(nèi)視為“金標(biāo)準(zhǔn)”技術(shù)，是一種非標(biāo)記、全局性的數(shù)據(jù)，可被應(yīng)用在生物制藥及小分子藥物研發(fā)和生產(chǎn)中，在學(xué)術(shù)領(lǐng)域研究分子間相互作用時(shí)也可發(fā)揮強(qiáng)大的作用。

關(guān)注馬爾文帕納科公眾號(hào)，獲取MicroCal PEAQ-DSC系統(tǒng)電子產(chǎn)品冊(cè)。

關(guān)于馬爾文帕納科

馬爾文帕納科的使命是通過(guò)對(duì)材料進(jìn)行化學(xué)、物性和結(jié)構(gòu)分析，打造出更勝一籌的客戶(hù)導(dǎo)向型創(chuàng)新解決方案和服務(wù)，從而提高效率和產(chǎn)生可觀的經(jīng)濟(jì)效益。通過(guò)利用包括人工智能和預(yù)測(cè)分析在內(nèi)的最近技術(shù)發(fā)展，我們能夠逐步實(shí)現(xiàn)這一目標(biāo)。這將讓各個(gè)行業(yè)和組織的科學(xué)家和工程師可解決一系列難題，如最大程度地提高生產(chǎn)率、開(kāi)發(fā)更高質(zhì)量的產(chǎn)品，并縮短產(chǎn)品上市時(shí)間。

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