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掃描電鏡論文賞析

論文標(biāo)題：

The transcription factor PtoMYB142 enhances drought tolerance in Populus tomentosa by regulating gibberellin catabolism（PtoMYB142 通過調(diào)控赤霉素代謝增強(qiáng)楊樹抗旱性的研究）

使用儀器：飛納臺(tái)式掃描電鏡 

發(fā)表期刊：the Plant Journal

因全球變暖增大了樹木因干旱而死亡的生態(tài)壓力，推動(dòng)著樹木節(jié)水策略的演變。盡管植物激素與對(duì)缺水的形態(tài)適應(yīng)有關(guān)，但木本植物中這些過程的分子機(jī)制仍不清楚。本篇文章中報(bào)道了 PtoMYB142 在毛白楊中的過表達(dá)導(dǎo)致矮化表型，葉細(xì)胞大小、導(dǎo)管的導(dǎo)腔面積和莖木質(zhì)部導(dǎo)管密度減小，導(dǎo)致抗旱性顯著增強(qiáng)。文中使用飛納臺(tái)式掃描電鏡對(duì)各株系的葉片進(jìn)行觀測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)細(xì)胞大小確實(shí)存在顯著差異。本篇文章研究為樹木抗旱性的分子機(jī)制提供了見解，有可能為增強(qiáng)樹木抗旱性提供新的轉(zhuǎn)基因策略。

PtoMYB142 通過直接結(jié)合干旱脅迫誘導(dǎo)的 PtoGA2ox4，aGA-氧化酶基因的啟動(dòng)子來(lái)調(diào)節(jié)赤霉素（GAs）解代謝。相反，CRISPR/Cas9 系統(tǒng)敲除 PtoMYB142 會(huì)降低抗旱性。結(jié)果表明，在干旱脅迫下，葉片尺寸和導(dǎo)管管腔面積的減小以及荊糠密度的增加提高了葉片相對(duì)含水量和莖稈水勢(shì)。此外，外源 GA3 的應(yīng)用挽救了 PtoMYB142 表達(dá)植株的 GA 缺陷表型，并逆轉(zhuǎn)了其抗旱性。通過抑制 PtoGA2ox4 的表達(dá)，抑制了 PtoMYB142 表達(dá)楊樹 GA 缺陷特性的表現(xiàn)，以及賦予的抗旱性。

有趣的是PtoMYB142-0E株系的葉面積(從第2片到第7片葉)明顯小于WT,而PtoMYB142Cas9 株系的葉面積更大(圖 1a.b)。掃描電子顯微鏡(SEM)分析顯示，與WT 相比PtoMYB142-0E 和 PtoMYB142-Cas9 系之間的葉細(xì)胞大小存在顯著差異(圖 1c，d)PtoMYB142-OE 系的近軸和近軸表皮細(xì)胞面積均顯著減少，但相對(duì)于WT，PtoMYB142-Cas9 系的表皮細(xì)胞面積擴(kuò)大（圖1e，f）。這些結(jié)果表明，PtoMYB142 在干旱脅迫下葉片發(fā)育中起著至關(guān)重要的作用。

用甲苯胺藍(lán)染色橫截面，顯示與 WT 相比，PtoMYB142-OE 系的次生木質(zhì)部發(fā)育受到顯著抑制，因?yàn)闇p弱的木質(zhì)部細(xì)胞層和莖中木質(zhì)部占有率降低（圖2a-c）。相反，PtoMYB142-Cas9 品系顯示出增加的木質(zhì)部細(xì)胞層和更大的莖中的木質(zhì)部占有率（圖2a-c）。盡管在 PtoMYB142-OE 系中木質(zhì)部發(fā)育受到抑制，但其導(dǎo)管密度明顯高于 WT，導(dǎo)管管腔面積顯著減少（圖2d-g）。相比之下，在 PtoMYB142-Cas9 系的莖木質(zhì)部中觀察到導(dǎo)管密度降低和導(dǎo)管管腔增大（圖2d-g）?？傊?，Pto-MYB142 可能在調(diào)節(jié)楊樹葉莖形態(tài)發(fā)育中發(fā)揮作用，以增強(qiáng)其對(duì)水分脅迫的適應(yīng)。

結(jié)果表明，PtoMYB142 過表達(dá)抑制了轉(zhuǎn)基因楊樹植株的生長(zhǎng)，而敲除該基因?qū)е孪喾吹谋硇?。定量分析表明，與 3 個(gè)月齡的 WT 植株相比，PtoMYB142 過表達(dá)（PtoMYB142-OE）植株的株高降低了 36-42%，PtoMYB142-Cas9 品系的植株高度增加了 26-30%。此外，PtoMYB142-OE 楊樹的莖直徑減少了 23-30%，PtoMYB142-Cas9 植株的莖直徑增加了15-22%。此外，與 WT 相比，PtoMYB142 的過表達(dá)導(dǎo)致節(jié)間較短，而該基因的敲除導(dǎo)致節(jié)間較長(zhǎng)。綜上所述，這些發(fā)現(xiàn)表明 PtoMYB142 負(fù)向調(diào)控楊樹的空中生長(zhǎng)。

文章研究了 PtoMYB142 在調(diào)控楊樹次生生長(zhǎng)和耐旱性中的作用。結(jié)果表明，PtoMYB142 調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)基因植株的 GA 生物合成，降低轉(zhuǎn)基因植株的 GA 水平，增強(qiáng)表型可塑性，提高耐旱性。研究結(jié)果表明，PtoMYB142 通過直接激活 PtoGA2ox4 的轉(zhuǎn)錄來(lái)積極調(diào)節(jié)耐旱性，PtoGA2ox4 是一種編碼 GA 分解代謝酶的基因。結(jié)果，轉(zhuǎn)基因植物在缺水時(shí)改變了葉和莖的次生維管發(fā)育。這些發(fā)現(xiàn)為 PtoMYB142 通過調(diào)節(jié) GA 水平參與楊樹抗旱性的分子機(jī)制提供了新的思路。

文章中設(shè)計(jì)了一種功能互補(bǔ)實(shí)驗(yàn)，通過對(duì)PtoMYB142-OE 植株進(jìn)行基于 RNA 干擾（RNAi）的敲低 PtoGA2ox4。轉(zhuǎn)基因和 WT 植株的表型分析表明，敲低 PtoGA2ox4 表達(dá)可以挽救 PtoMYB142 過表達(dá)引起的 GA 缺陷表型，包括植株高度和莖粗（圖S13）。轉(zhuǎn)基因 PtoGA2ox4RNAi / PtoMY-B142-OE 植株的毛皮、葉片大?。▓DS14）以及近軸和遠(yuǎn)軸表皮細(xì)胞大小幾乎恢復(fù)到 WT 植株的毛皮大小（圖6a-d）。同時(shí)，莖中每條導(dǎo)管的導(dǎo)管密度和導(dǎo)管管腔面積也幾乎恢復(fù)到 WT 水平（圖6e-g）。

通過控制 WT、PtoMYB142-OE和 PtoGA2ox4RNAi / PtoMYB142-OE 植株的土壤相對(duì)含水量（RWC）進(jìn)行干旱試驗(yàn)。結(jié)果表明，WT 和 PtoGA2ox4RNAi / PtoMYB142-OE 株系對(duì)缺水條件的敏感性高于 PtoMYB142-OE 株系（圖7a-c）。葉片相對(duì)含水量（圖7d）、莖水勢(shì)（圖7e）和株高（圖7f）的定量測(cè)量證實(shí)，PtoGA2ox4 可以阻斷 PtoMYB142 介導(dǎo)的抗旱性。總之，這些 發(fā)現(xiàn)表明，PtoMYB142-OE 和 PtoGA2ox4 依賴性調(diào)控在干旱條件下的葉片生長(zhǎng)和莖木質(zhì)部發(fā)育中起著至關(guān)重要的作用。

總體而言，我們的研究強(qiáng)調(diào)了 Pto-MYB142 在調(diào)控楊樹植物結(jié)構(gòu)和耐旱性中的關(guān)鍵作用，并提供了對(duì)植物生長(zhǎng)與干旱響應(yīng)之間串?dāng)_的分子機(jī)制的見解（圖8）。我們的 研究結(jié)果表明，PtoMYB142 的過表達(dá)可能是提高楊樹植株抗旱性的一種有前途的策略。

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