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摘要

小球藻因其高蛋白質(zhì)含量和與世界衛(wèi)生組織（WHO）推薦的人類營養(yǎng)素相似的氨基酸譜，以及富含人體必需營養(yǎng)素，廣泛應用于食品和飼料工業(yè)領域1。此外，小球藻在不利的生長條件下可積累C16和C18脂肪酸2,3，為污水處理廠生產(chǎn)生物燃料提供了可能1。

我們將為您展示搭載LAM的BioLector XT高通量微型生物反應器，適用于小球藻的光自養(yǎng)培養(yǎng)。此外，專門設計并驗證的濾光片模塊支持多種關鍵培養(yǎng)參數(shù)的在線監(jiān)測。

概述

通常，小球藻是通過搖瓶在有限的實驗通量下進行培養(yǎng)。培養(yǎng)條件優(yōu)化、藻株篩選和藻株工程是商業(yè)化的三大關鍵步驟4，例如，通過縮短葉綠素天線尺寸以最大限度地提高太陽能-產(chǎn)物能量轉換效率5。基于微孔的培養(yǎng)設備為微生物和哺乳動物細胞早期快速篩選提供了一種強大的工具6，并已成功應用于異養(yǎng)微藻生物工藝開發(fā)7。

微型光照生物反應器（μPBR）系統(tǒng)，可用于研究自養(yǎng)或混合營養(yǎng)培養(yǎng)條件，但目前的概念離系列技術還很遠，進一步的改進——尤其是可調(diào)節(jié)照明——是必要的8,9。

搭載精密光照模塊的BioLector XT高通量微型生物反應器，可在多達48個微孔中同時進行光營養(yǎng)培養(yǎng)。通過專門設計的濾光片模塊，可實現(xiàn)非侵入式、實時在線監(jiān)測關鍵培養(yǎng)參數(shù)如生物量、葉綠素濃度和pH值。光照模塊（LAM）在光合光譜范圍內(nèi)提供精確、多樣化的光照方案。其光譜的靈活性是通過16種不同的LED實現(xiàn)的，每一個LED都可以單獨控制，可提供近4000 μmol/m2/s的最大輻射。

方法

濾光片模塊開發(fā)

經(jīng)專門設計并測試的濾光片模塊，可用于在線監(jiān)測多種重要的光營養(yǎng)培養(yǎng)參數(shù)（生物量、葉綠素含量和pH值）。

小球藻

無菌小球藻（SAG藻株編號211-11b）由哥廷根大學藻種保藏中心提供。

培養(yǎng)基

在pH值為6.5的改良Bold基礎培養(yǎng)基（enBBM）中進行培養(yǎng)10-13。

在搖瓶中預培養(yǎng)

將小球藻置入振幅為50mm的搖瓶中，在25℃培養(yǎng)箱中以180rpm振速進行預培養(yǎng)。為實現(xiàn)光營養(yǎng)生長，在培養(yǎng)室的一側安裝LED模塊，同時在搖瓶口使用棉塞，方便氣體出入培養(yǎng)液。LED模塊由8個平行安裝的模擬太陽光LED燈條組成（LUMITRONIX LED-Technik GmbH）。將輻照度設置為200μmol/m2/s，使之與BioLector XT微型生物反應器培養(yǎng)時的輻照度一致。

在BioLector XT微型生物反應器中培養(yǎng)

采用Flowerplate梅花板[M2P-MTP-48-B]進行光營養(yǎng)培養(yǎng)，初始細胞密度為5.5*106個細胞/mL，培養(yǎng)體積為1mL。用透氣性密封膜（MTP-F-GPRS-48-10）密封微孔板，方便光合作用期間二氧化碳和氧氣的交換。照明模塊設置為提供400~700nm的類太陽光譜，光子通量密度約為200 μmol/m2/s（圖1）。

圖1. 培養(yǎng)期間的照明光譜和輻照度

將培養(yǎng)參數(shù)設置為800 rpm、25℃和85% 的相對濕度，并按10 mL/min流速充入空氣和 2% 的CO2混合物。

結果

濾光片模塊校準

圖2.濾光片模塊校準結果圖組

生物量

經(jīng)專門開發(fā)的730、750和850 nm生物量濾光片模塊，可在0.3≦OD750≦25范圍內(nèi)顯示出卓越的校準效果，730 nm模塊校準結果如圖2.A所示。此外，使用葉綠素a和葉綠素b標準品，未發(fā)現(xiàn)葉綠素干擾。

葉綠素含量

葉綠素校準結果顯示，經(jīng)專門設計的濾光片模塊可單獨或同時檢測葉綠素a和葉綠素b，如圖2.B所示。

葉綠素熒光常用于測定光營養(yǎng)培養(yǎng)物的生物量14,15。因此，使用生物量系列稀釋液進行校準，應用指數(shù)遞減擬合時，在低生物量濃度下可觀察到極佳的分辨率如圖2.C所示。校準結果證實，葉綠素熒光濾光片器可準確測定生物量濃度，特別是在生物量濃度較低的時候。

pH值

分別在25、30、35和40℃下，使用含0.1 mg/L HPTS的pH 5~10緩沖溶液（Merck, Darmstadt, DE）對pH濾光片模塊進行校準。校準結果出色（圖2.D），證明所該設置適用于在線準確測定pH值。

為確保擬定方法對光漂白不敏感，我們在BioLector XT微型生物反應器中使用無接種物enBBM在200μmol/m2/s典型培養(yǎng)條件進行培養(yǎng)實驗（圖2.E）。實驗開始后，CO2濃度的增加使培養(yǎng)基迅速酸化（~0.05pH），但在之后的130小時內(nèi)，測量值（圖2.E）始終保持恒定。這一點證明，在連續(xù)光照的培養(yǎng)條件下，使用HPTS測定pH，可連續(xù)多日保持準確、穩(wěn)定的測量水平。

在BioLector XT微型生物反應器中并行光營養(yǎng)培養(yǎng)

經(jīng)過對濾光片模塊進行驗證之后，我們開始長期培養(yǎng)，并使用四個濾光片模塊進行在線監(jiān)測：730nm的散射光模塊，葉綠素熒光濾光片模塊（λex=450nm；λem=700nm）和兩種HPTS濾光片模塊進行比值pH測定(圖3)

圖3. 搭載光照模塊的BioLector XT微型生物反應器，為期16天的培養(yǎng)中所監(jiān)測的散射光、葉綠素和pH值

如圖3所示，為期16天的培養(yǎng)監(jiān)測中，生物量濃度持續(xù)增加，直至CO2供應被關閉。圖中可觀察到五個不同的生長階段：

首先是滯后的指數(shù)生長期（i.），之后是三個不同的線性生長期（II.至IV.），最后是CO2耗盡后進入的死亡階段（V.）。pH和葉綠素信號的變化過程與觀察到的生長階段相關。在整個實驗過程中，散射光信號的平均變異系數(shù)為5.2%，因此可在建議的設置中進行平行光營養(yǎng)培養(yǎng)。離線樣本驗證了在線信號的準確性。235小時后采樣（此時由于短暫暴露于大氣中的CO2濃度中，pH值升高），離線OD750值為40，離線pH值為7.3，這與在線測定的pH值7.2高度一致。在實驗結束時，離線OD750值為60左右，表明在實驗過程中培養(yǎng)物生長旺盛導致產(chǎn)生較高的生物量濃度。

結論

光照模塊的加入為BioLector開創(chuàng)了全新的應用領域。本文應用案例中所介紹的幾種濾光片模塊，可準確監(jiān)測關鍵的光營養(yǎng)培養(yǎng)參數(shù)，如生物量濃度、葉綠素含量和pH值。

葉綠素熒光濾光片模塊在低濃度生物量測定中具有良好的分辨率，與在高細胞密度下準確的散射光測量相得益彰16。此外，研究證明，基于HPTS的pH測定法是替代optode測量的理想解決方案，即便在連續(xù)照明的條件下，該方法也同樣適用。

小球藻的長期培養(yǎng)證實，BioLector系統(tǒng)可用作并行、高通量培養(yǎng)的微升級光照生物反應器。此外，經(jīng)專門設計的濾光片模塊可評估培養(yǎng)物生長的在線信息，并揭示不同的生長階段。

這些結果證實該平臺可通過不同方式優(yōu)化各種應用的光營養(yǎng)培養(yǎng)。精心設計的光照模塊，支持在不同照明條件下設置較寬的光譜和輻照度范圍，以便優(yōu)化照明條件。多篇文獻已報道這些照明特性可影響藻類生長9,17-21。

在BioLector XT中，可通過氣體流量和氣體成分改變實驗的氣體培養(yǎng)條件，這是光營養(yǎng)培養(yǎng)中的一個重要參數(shù)，例如，CO2富集可獲得更高的生物量濃度1,19。其他影響微藻培養(yǎng)的關鍵因素包括溫度22,23、pH1,20、鹽度24、碳源25-27、氮源19,27和培養(yǎng)基成分28。BioLector XT可優(yōu)化所有這些參數(shù)。此外，建議采用分批補料培養(yǎng)來提高脂質(zhì)產(chǎn)量29。由于監(jiān)管限制，有關基因工程藻株潛力的研究和應用極少，但藻株經(jīng)基因改造，可能具有更高的生長速率和細胞密度，更高的生產(chǎn)速率或滴度，更強的魯棒性或更好的太陽能-生物量轉換效率和光合生產(chǎn)力30,5,31,32。

所有這些因素均可通過搭載LAM的BioLector XT微型生物反應器進行研究和優(yōu)化，助力研究人員加快研究進程，為實現(xiàn)藻類潛能所需的答案提供幫助。

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