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針對(duì)藥物研發(fā)高通量篩選應(yīng)用特點(diǎn)，我們?cè)谥暗耐莆摹丁皹O速”賦能 | 超高通量自動(dòng)化系統(tǒng)加速藥物研發(fā)》中介紹了幾種不同設(shè)計(jì)的自動(dòng)化整合系統(tǒng)。整合Echo? MS質(zhì)譜系統(tǒng)，可完成超高通量的樣本處理及檢測，大大提高測試效率，加速研發(fā)進(jìn)程。在合成生物學(xué)領(lǐng)域，基于“設(shè)計(jì)-構(gòu)建-測試-學(xué)習(xí)”（DBTL）循環(huán)策略可以成功構(gòu)建需要的細(xì)胞，生產(chǎn)出合適的產(chǎn)品，流程中需要海量工程化實(shí)驗(yàn)去驗(yàn)證和實(shí)現(xiàn)其預(yù)設(shè)功能，使用高通量自動(dòng)化整合系統(tǒng)將顯著縮短DBTL循環(huán)周期。

快速、準(zhǔn)確、同時(shí)定量多種代謝物是菌株性能多角度評(píng)估和菌株篩選的關(guān)鍵，基于質(zhì)譜檢測技術(shù)可以實(shí)現(xiàn)多目標(biāo)定量，但繁瑣的樣品前處理及耗時(shí)的色譜分離過程阻礙了其在合成生物學(xué)的大規(guī)模應(yīng)用。近日，中國科學(xué)院天津工業(yè)生物技術(shù)研究所在Journal of Pharmaceutical Analysis發(fā)表的論文“Automated and integrated ultrahigh throughput industrial strain screening enabled by acoustic-droplet-ejection mass spectrometry”提到利用自動(dòng)化系統(tǒng)整合Echo? MS質(zhì)譜系統(tǒng)，成功搭建了超高通量前處理與分析（Ultrahigh Throughput Pretreatment and Analysis，UTPA）平臺(tái)，并首次應(yīng)用于生物發(fā)酵樣品，平臺(tái)的樣品前處理及質(zhì)譜檢測全流程自動(dòng)化實(shí)現(xiàn)了秒級(jí)尺度的速度，40分鐘內(nèi)從348個(gè)菌株中篩選到9個(gè)綜合性能具有明顯優(yōu)勢(shì)的谷氨酸生產(chǎn)菌株，與傳統(tǒng)的LC-MS方法相比（篩選時(shí)間約2天，7.5min/樣），篩選過程加快了72倍。

UTPA 平臺(tái)介紹

part 1UTPA平臺(tái)為自動(dòng)化整合系統(tǒng)，由定制化的樣品前處理系統(tǒng)和聲波激發(fā)質(zhì)譜（Echo? MS）系統(tǒng)兩部分組成（見下圖）。其中樣品前處理系統(tǒng)以貝克曼庫爾特生命科學(xué)Biomek i7液體處理工作站為核心（配備震蕩模塊和溫控模塊），在工作站左側(cè)和右側(cè)分別臺(tái)面整合儲(chǔ)板棧和正壓過濾模塊，可直接通過工作站內(nèi)部抓手完成這3種設(shè)備之間的耗材快速轉(zhuǎn)移。同時(shí)在工作站右側(cè)連接1條傳輸軌道，便于工作站通過外置機(jī)械臂與高速冷凍離心機(jī)和聲波激發(fā)質(zhì)譜系統(tǒng)的物理聯(lián)動(dòng)，完成實(shí)驗(yàn)板的來回自動(dòng)轉(zhuǎn)移傳遞。聲波激發(fā)質(zhì)譜系統(tǒng)由聲波液滴激發(fā)器（Echo）、開放端口探針采樣接口（OPI）和三重四極桿質(zhì)譜儀（SCIEX 6500+）組成，通過聲波液滴激發(fā)器使孔內(nèi)樣本以納升級(jí)進(jìn)樣，檢測速度可達(dá)1s/樣。高度自動(dòng)化的UTPA平臺(tái)可實(shí)現(xiàn)超高通量樣本前處理和檢測分析全流程自動(dòng)化無人值守，且在該平臺(tái)上方法開發(fā)及數(shù)據(jù)處理簡單，成本低，相比較LC-MS檢測方法，聲波激發(fā)質(zhì)譜系統(tǒng)不需要使用色譜柱，試劑消耗量也大為減少，平均每檢測2000個(gè)樣本可節(jié)約成本大于5000元。

圖1：UTPA平臺(tái)裝備布局

UTPA 平臺(tái)實(shí)驗(yàn)流程

part 2研究人員使用UTPA平臺(tái)篩選了基于SCg5的谷氨酸高產(chǎn)菌株庫中的部分菌株，同時(shí)檢測了谷氨酸（主產(chǎn)物）、葡萄糖（底物）、谷氨酰胺（可能的干擾物和副產(chǎn)物）和乳酸（副產(chǎn)物）的濃度。菌株接種于96孔板培養(yǎng)后，放入U(xiǎn)TPA平臺(tái)的儲(chǔ)板棧，同時(shí)將所需的試劑耗材放入儲(chǔ)板棧，運(yùn)行實(shí)驗(yàn)程序，平臺(tái)將自動(dòng)化執(zhí)行菌株發(fā)酵液的前處理及檢測步驟，完成菌株篩選。具體實(shí)驗(yàn)流程如下圖：

圖2：UTPA平臺(tái)工作流程

整個(gè)測試流程中，1塊384孔板樣本的前處理時(shí)間不到20min。聲波激發(fā)質(zhì)譜系統(tǒng)可以對(duì)檢測樣本設(shè)置不同滯留時(shí)間，每個(gè)樣本進(jìn)樣檢測所需時(shí)間波動(dòng)在1-3s，384個(gè)樣本檢測大約需要7-20min。本實(shí)驗(yàn)對(duì)聲波激發(fā)質(zhì)譜系統(tǒng)做了參數(shù)優(yōu)化以提高檢測靈敏度和盡量減少干擾，如優(yōu)化了MRM離子對(duì)參數(shù)，載液組成以及流速等，在此優(yōu)化設(shè)置下384個(gè)樣本檢測分析時(shí)間需要20.2min，因此測試全流程完成1塊384孔板的樣本需要40min，平均每個(gè)樣本耗時(shí)6.25s。使用平臺(tái)執(zhí)行多塊384孔板運(yùn)行時(shí)，系統(tǒng)軟件會(huì)對(duì)不同板之間的流程自動(dòng)做時(shí)序優(yōu)化，縮短多塊板的全流程時(shí)間，第一塊384孔板在聲波激發(fā)質(zhì)譜系統(tǒng)檢測的同時(shí)，第二塊板的樣本正被放于前處理系統(tǒng)執(zhí)行前處理步驟，2板之間可以優(yōu)化節(jié)約20min，1天時(shí)間可以處理71塊384孔板，通量可高達(dá)27000+個(gè)樣本/天。

研究者參照工業(yè)生物分析方法驗(yàn)證指導(dǎo)原則使用UTPA平臺(tái)先針對(duì)谷氨酸、葡萄糖、谷氨酰胺和乳酸這4種化合物進(jìn)行方法學(xué)驗(yàn)證，然后開展了篩選實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)了更科學(xué)的多指標(biāo)評(píng)價(jià)策略，不單單只根據(jù)主產(chǎn)物的濃度來挑選陽性菌株，還綜合考慮了底物-產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化率，因?yàn)榈孜?通常是葡萄糖)在谷氨酸等大宗化學(xué)品生產(chǎn)中占據(jù)了50%以上的生產(chǎn)成本。根據(jù)最大化谷氨酸濃度和轉(zhuǎn)化率，同時(shí)最小化副產(chǎn)物乳酸和谷氨酰胺產(chǎn)量的評(píng)價(jià)策略，從348個(gè)菌株篩選出了9個(gè)綜合性能具有明顯優(yōu)勢(shì)的谷氨酸生產(chǎn)菌株（見下圖），把陽性率從單一指標(biāo)評(píng)價(jià)篩出的14.9% (52/348)降低到2.6% (9/348)，大大減少了進(jìn)一步使用更大規(guī)模生物反應(yīng)器復(fù)篩的工作量和時(shí)間。

圖3：基于UTPA平臺(tái)的谷氨酸高產(chǎn)菌株篩選

搭配自動(dòng)化系統(tǒng)來完成前端樣本處理能完美實(shí)現(xiàn)下游質(zhì)譜檢測的超高通量，UTPA平臺(tái)成為此類自動(dòng)化整合系統(tǒng)的典范，它實(shí)現(xiàn)了全流程自動(dòng)化無人值守，不限體系（酶反應(yīng)、發(fā)酵液、化學(xué)反應(yīng)…），不限菌種（大腸桿菌、谷氨酸棒狀桿菌、釀酒酵母…）和不限檢測物質(zhì)（氨基酸、有機(jī)酸、單糖、多糖…）。UTPA是首個(gè)實(shí)現(xiàn)樣品前處理與檢測分析全部過程達(dá)秒級(jí)水平的自動(dòng)化分析平臺(tái)，首次應(yīng)用于合成生物學(xué)領(lǐng)域，隨著應(yīng)用的深入，將顯著縮短合成生物學(xué)DBTL循環(huán)周期，加快生命科學(xué)研究、細(xì)胞工廠/酶以及生物工藝的開發(fā)。

 ● 參考文獻(xiàn)： 

Zhidan Zhang, Chao Zhang, Xu Zhang, Jiuzhou Chen, Ningyun Cai, Shasha Zhong, Zhibo Han, Yan Zhu, Ping Zheng, Jibin Sun, Changxiao Li. Automated and integrated ultrahigh throughput industrial strain screening enabled by acoustic-droplet-ejection mass spectrometry, Journal of Pharmaceutical Analysis, 2024文獻(xiàn)鏈接：10.1016/j.jpha.2024.02.003

 ● 特別感謝論文第一作者張志丹老師幫忙審核這篇文稿。