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優(yōu)勢摘要：

• 全自動樣品制備工作流程，同時處理多達576份樣品；

• 端到端自動化解決方案，突破樣品制備瓶頸制約；

01可擴展的樣品制備

隨著采集速度更快、靈敏度更高的質譜儀產品的相繼問世，蛋白質組學已躍升為引領學術探索和工業(yè)研究多個應用領域的重要工具。

隨著蛋白質組學研究的不斷深入以及樣品分析日益常態(tài)化，對標準化和可擴展解決方案的需求愈發(fā)迫切。為了滿足這一需求，我們專門為Biomek i5自動化移液工作站量身打造了四項全新升級的全自動工作流程。這些流程與 Evosep 技術無縫集成，可確保高效、可重復的端到端樣品制備。Biomek i5自動化移液工作站可并行處理多達6塊孔板，單次運行可輕松處理576份樣品，并且樣品可自動加載至Evotips進行分析。該過程顯著縮短了上樣時間，6塊板的消化酶解過程僅需3小時，過夜消化僅需18小時。

Evotip 樣品上樣

該工作流程采用原裝密封專用適配器，可在 Evotip 上實現樣品自動脫鹽和上樣，以便在下游 LC-MS 分析前高效儲存樣品。

消化酶解工作流程

PAC（蛋白聚集捕獲）1消化酶解工作流程，利用蛋白在磁珠表面的聚集，直接在磁珠上消化還原和烷基化蛋白質裂解物。

Neat Plasma（純血漿）分析工作流程

該工作流程將還原與烷基化步驟相結合，利用 PAC 消化酶解作為大隊列血漿樣品的簡化處理方法。

Mag-Net Plasma（富集血漿）分析工作流程

Mag-Net（富集）2工作流程將膜結合囊泡的富集與 PAC消化酶解過程全面結合，有利于血漿蛋白質組學的深度研究。

02方法詳述

首先，將 HeLa細胞在含有10%FBS的DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)，隨后加入5%的SDS緩沖溶液煮沸收獲。實驗過程中，采用了搭載300μl的多通道移液頭的Biomek i5 MC（貝克曼庫爾特生命科學）自動化移液工作站、BioShake（D30-T elm, Q-Instruments）和Magnum FLX 磁力載架（Alpaqua）。

進行 PAC 消化酶解時，將1μg HeLa裂解物與5μl MagReSyn羥基磁珠（Resyn Biosciences）混合。將異丙醇添加至80%的濃度并在BioShake模塊上混勻。蛋白結合在磁珠上后，用異丙醇進行一次洗滌，之后，在 37°C 或環(huán)境溫度（板間變異實驗）下用 40ng 胰蛋白酶（T6567, Sigma Aldrich）和 10ng Lys-C（129-02541, Wako Fujifilm）進行過夜（16小時）消化酶解。將樣品稀釋至適當濃度，然后再上樣至Evotips。

血漿按照早期檢測研究網絡（EDRN）規(guī)定的標準操作流程3進行提取。進行純血漿分析時，在稀釋之前將 1 μl 血漿進行裂解、還原和烷基化，并使用約2 μg蛋白進行消化酶解。之后加入5 μl羥基磁珠開始PAC消化酶解步驟。消化酶解后，將所得肽段的40%上樣至 Evotips。進行Mag-Net富集時，將4 μl血漿與磁珠結合緩沖液和1 μl MagReSyn SAX磁珠（ReSyn Biosciences）按1:1比例混合。隨后在三次洗滌以及一鍋法裂解、還原和烷基化步驟后，如上所述步驟進行 PAC 消化酶解。在37°C下過夜消化酶解后，將所得肽段的80%上樣至Evotips。

03專為大規(guī)模分析構建

該工作流程旨在實現高效且具成本效益的大隊列樣本分析。將 Evotip 上樣作為每個工作流程的最后步驟，樣品將安全儲存至 Evotip Pure，直至完成 LC-MS 分析。這種方法通過僅消化所分析的內容，利用和分析接近100%的消化樣品，通過減少酶和樣品消耗來最大限度地降低每個樣品的成本。此外，該工作流程使用單一樣品專用吸頭和共用移液吸頭，可確保高通量樣品制備的持續(xù)運行。采用孵育步驟以交叉方式處理多個96孔板，顯著提高了整體實驗通量。因此，當同時處理6塊每塊內含96份樣品的孔板時，每個工作流程中每份樣品的總處理時長不到 2 分鐘，總共僅需 18小時的處理時間。

采用 500 SPD 方法分析板間變異樣品，并采用 200 SPD 方法分析所有其他樣品。EV1107 色譜柱（Evosep）在室溫下操作，用于在 timsTOF HT 質譜儀（Bruker）上進行的所有實驗，默認采用“短梯度直徑-PASEF MS 方法”。使用無庫模式的 DIA-NN（版本 1.8.1）與人類蛋白質組數據庫（Uniprot，2020 年 10 月，20,600 個無亞型條目）進行數據分析，胰蛋白酶/P作為蛋白酶，允許2次遺漏切割。分析時，對所有條件進行單獨搜索，并在同一條件下進行的重復實驗啟用運行間匹配。

圖 1：Biomek i5 自動化移液工作站臺面布局圖以及基于每個工作流程處理 1-6 塊板時每份樣品所花費時間的通量示意圖。

04全面集成的自動化解決方案

利用 Bioshake 振蕩模塊在 37 °C下過夜消化酶解，以確保最佳消化酶解效果，并使用密封蓋密封以防止樣品蒸發(fā)，并獲得實驗數據。該實驗同樣適用更短的消化酶解時間。我們處理了一個具有兩種不同 HeLa起始量和兩種空白類型的樣品板，結果發(fā)現未出現交叉殘留污染，這一點可通過空白中忽略不計的信號強度加以證明。在 timsTOF HT上使用200 SPD方法進行質譜分析，當蛋白質上樣量為1 μg時，我們從每份樣品中鑒定出5,500個蛋白質，上樣量為500 ng時，鑒定出4,900 個蛋白。

當處理6塊上樣量為1 μg HeLa的孔板時，未出現板間變異，蛋白質水平的高 Pearson 相關系數證明了這一點。此外，我們還觀察到高效、可重復的消化酶解過程，以及在所有工作流程中，蛋白水平中位變異系數（CV）均低于 20%。Evosep技術與Biomek i5自動化移液工作站的全面整合，無縫集成了可擴展的樣品制備和 LC-MS 分析工作流程，確保獲得可重復的高質量結果。

圖 2：PAC HeLa 板（80% 上樣和 200 SPD 法）的總信號強度和 6 塊板（40% 上樣和 500 SPD 法）的蛋白 Pearson 相關系數熱圖。采用 200 SPD 法分析的工作流程的消化酶解效率和蛋白組 CV。

05卓越的血漿蛋白質組學分析技術

非靶向血漿蛋白質組學在監(jiān)測疾病發(fā)生和進展相關的臨床研究中應用前景巨大。Evosep配備移液吸頭形式的一次性捕獲柱，是處理血漿等具有挑戰(zhàn)性的樣品類型的理想平臺。因此，本文所描述的純血漿分析和Mag-Net富集工作流程，可為大規(guī)模生物醫(yī)學應用提供強大的分析利器。

為了證明工作流程的有效性，我們使用1 μl血漿制備了40份純血漿樣品，并使用4 μl血漿初始量制備了40份Mag-Net 富集樣品。純血漿分析表現出出色的分析深度，采用標準200 SPD方法鑒別出500種蛋白。

Mag-Net富集分析成功壓縮了動態(tài)范圍，采用200 SPD方法鑒別出2,700種蛋白，是純血漿分析蛋白鑒別數量的 5 倍以上。在已鑒別的蛋白中，有40 種已在Vesiclepedia數據庫中列出，其中多數蛋白CV 均低于20%，驗證了該工作流程的有效性。最后，我們分別選擇了一種高豐度血漿蛋白（ALB）、一種 EV 標志物（CD63）和一種已知的癌癥生物標志物（ALDOA），并繪制了這三種樣品在兩種分析條件下所有40次重復的豐度。重復結果間的高度相似性表明，全面集成解決方案可跨重復的工作流程實現穩(wěn)健可靠的實驗結果。

圖 3：純血漿（1 μl，40% 上樣）和 Mag-Net 血漿（4 μl，80% 上樣）的動態(tài)范圍。蛋白組 CV 與豐度以及豐度與所選蛋白分布的散點圖。采用 200 SPD 法分析樣品。

06結論

Biomek i5 自動化移液工作站與 Evosep 技術的完美融合，為高通量蛋白質組學分析領域帶來了前所未有的強大且靈活的解決方案。我們的自動上樣、PAC 消化酶解、純血漿分析和 Mag-Net 富集分析等自動化工作流程，充分展現了其卓越的實驗通量、重現性和分析深度。這些自動化工作流程極大減少了人工干預，大幅降低了成本，幫助用戶輕松處理同類樣本的大隊列研究，因而成為常規(guī)分析和大規(guī)模研究的首選平臺。通過將尖端自動化技術與液相色譜技術的全面融合，我們的解決方案充分滿足了市場對標準化和可擴展蛋白質組學方案日益增長的需求。這些方案為臨床研究和工業(yè)應用中追求高質量蛋白質組學研究的客戶，開辟了一條更加寬廣的科研道路。

Biomek 自動化移液工作站和Evosep One 儀器僅供研究使用，不用于臨床診斷。

參考文獻

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