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簡介

手性分子是一種有機(jī)化合物，它具有一種獨特的性質(zhì)，即互為不可重疊的鏡像。這意味著它們以兩種形式存在，稱為對映體，除了原子的三維排列外，它們在各方面都是相同的。雖然這些對映體具有相同的化學(xué)性質(zhì)，但它們可能具有不同的生物活性和藥理作用[1,2]。因此，手性分子在制藥工業(yè)中變得越來越重要，它們被用于開發(fā)藥物和其他治療方法，因此分離對映體十分重要。

超臨界流體色譜法(SFC)在手性分子的分離純化中，具有其他分離技術(shù)無法比擬的優(yōu)點。SFC 使用超臨界二氧化碳作為流動相，這是一種清潔和綠色的溶劑，很容易從最終產(chǎn)品中去除。此外，SFC 提供了高分辨率和快速的分離。

預(yù)測哪種固定相能夠有效分離 SFC 中特定的一組對映異構(gòu)體，即使在現(xiàn)在看來也是十分困難，這使得我們需要選擇合適的手性固定相來不斷試錯[2]。

手性 SFC 多采用與手性高效液相色譜(HPLC)相同的色譜柱，其中最常用的是多糖手性固定相(CSPs)，由于可以選擇不同改性的多糖，因此具有很強(qiáng)的通用性[3]。多糖 CSPs 具有高負(fù)載能力，這使得它們在制備規(guī)模應(yīng)用中非常有用。許多商業(yè)多糖手性固定相是可用的，主要是基于直鏈淀粉或纖維素和改性的鹵化或非鹵化芳香基團(tuán)。改性后的多糖可以包被或固定在二氧化硅載體上，以增強(qiáng)其對強(qiáng)溶劑的抵抗力[3]。還有其他 CSPs 通常用于手性 SFC 應(yīng)用，例如，Pirkle 型手性固定相[3]。

本文介紹了使用 Sepmatix 8x SFC 對反式二苯乙烯氧化物(TSO)進(jìn)行平行柱篩選，隨后通過方法優(yōu)化轉(zhuǎn)移到制備的 Sepiatec SFC-50。

設(shè)備

• Sepiatec SFC-50

• Sepmatix 8x SFC

• PrepPure cCDMPC, 5um, 250 x 4.6mm

• PrepPure cADMPC, 5um, 250 x 4.6mm

• PrepPure iADMPC, 5um, 250 x 4.6mm

• PrepPure iCDMPC, 5um, 250 x 4.6mm

• PrepPure iCDCPC, 5um, 250 x 4.6mm

• PrepPure iBT, 8um, 250 x 4.6mm

• PrepPure iBT, 8um, 250 x 10mm

試劑和耗材

• 二氧化碳(99.9%)

• 甲醇(≥99%)

• 乙醇(99%)

• 異丙醇(99%)

• 乙腈(99%)

• 反式二苯乙烯氧化物(99%)

（為了安全操作，請注意所有相應(yīng)的MSDS）

實驗過程

樣品制備：

在篩選和方法優(yōu)化時，將 0.075g 反式二苯乙烯氧化物溶解在 5.0mL 甲醇中；在堆疊注射時，將 0.1909g 反式二苯乙烯氧化物溶解于 6.0mL 甲醇中。

使用 Sepmatix 8x SFC 進(jìn)行篩選：

篩選完全是全自動運行，采用流量控制單元，將每通道內(nèi)的流量設(shè)置為 3mL/min，并將流量平衡。樣品自動進(jìn)樣（每根色譜柱 5μL），啟動平行篩選（運行時長=10分鐘）。背壓調(diào)節(jié)器設(shè)置為 150bar，柱溫箱設(shè)置為32℃。

使用 Sepiatec SFC-50 進(jìn)行制備：

PrepPure iBT 色譜柱在設(shè)定的流速下預(yù)熱 4 分鐘，樣品通過定量環(huán)自動進(jìn)樣并運行。背壓調(diào)節(jié)器設(shè)置為 150bar，柱溫箱設(shè)置為 40℃。

實驗結(jié)果

色譜柱篩選：

為了確定手性化合物 TSO 的最佳分離條件，進(jìn)行了不同手性色譜柱的篩選，使用 Sepmatix 8x SFC 允許同時進(jìn)行 8 根不同色譜柱的平行篩選。本實驗一共使用了 6 根不同色譜柱：Chiral iADMPC, Chiral iCDMPC, Chiral iCDCPC, Chiral iBT, Chiral cADMPC 和 Chiral cCDMPC。圖1 為色譜柱篩選結(jié)果，其中 Chiral iADMPC 色譜柱不能很好地分離對應(yīng)異構(gòu)體 TSO（可見表1），而 Chiral iCDMPC，Chiral iCDCPC，Chiral iBT，Chiral cADMPC 和 Chiral cCDMPC 色譜柱可以分離 TSO。

在處理復(fù)雜的混合物時，分辨率 R 是一個特別重要的參數(shù)，因為它衡量了每一次分離的程度，并且可以被準(zhǔn)確識別和量化。例如分辨率 R=1 表明了不理想的分離效果，兩個峰本質(zhì)上并沒有分離，更高的分辨率數(shù)值代表了更好的分離效果。在實際運行過程中，分辨率 R 至少達(dá)到 1.5 才會被認(rèn)為是分離的。表1 顯示了不同色譜柱分離 TSO 時的分辨率 R。在轉(zhuǎn)移至 SFC-50 制備時，選擇 iBT 色譜柱，因為它有最佳的分離效果，最容易實現(xiàn)轉(zhuǎn)移，進(jìn)樣量可大大提高。

表1. 使用 Sepmatix 8x SFC 篩選時不同色譜柱的分辨率

使用 SFC-50 進(jìn)行結(jié)果優(yōu)化

為了確定改性劑對 TSO 的影響，下列每一種改性劑都在等度條件下使用：PrepPure iBT, 8um, 250 x 10mm 色譜柱；甲醇，乙醇，異丙醇，乙腈 (見圖2)。

甲醇(偶極矩參數(shù)= 5[4])在對映體有足夠的峰距的情況下，僅在 3 分鐘內(nèi)分離 TSO。乙醇(偶極矩參數(shù)= 4[4])作為極性稍小的改性劑，分離所需時間略大于 3 min。異丙醇(偶極矩參數(shù)= 2.5[4])在不到 3.5 分鐘的時間內(nèi)分離 TSO，這是由于異丙醇的極性較小。乙腈(偶極矩參數(shù)= 8[4])在 2.25 分鐘內(nèi)最有效地分離 TSO。然而，甲醇被用作進(jìn)一步實驗的改性劑，因為它的窄峰寬和對稱峰有望帶來高進(jìn)樣量。此外，它比乙腈毒性更小，價格也更便宜。

由于流動相中改性劑的含量會因極性變化而對分離產(chǎn)生影響，所以采用了不同的甲醇含量(見圖3)。

流動相甲醇含量由 20% 連續(xù)增加到 35%，運行時間逐漸縮短。當(dāng)改性劑含量為 35% 時，運行時間可以從大約 3.5 分鐘縮短至約 2.5 分鐘。不過分辨率有所降低，對映體的峰寬也降低了。因此，在進(jìn)一步的實驗中，改性劑的濃度被設(shè)定為 35%。

每根色譜柱都有可達(dá)到最大效率或理論塔板數(shù)的固有最佳流速。如果流量減小或增大，則用非最佳分離塔板數(shù)進(jìn)行分離。與液相色譜法相比，SFC 可以使用更高的流速，而分離塔板數(shù)不會大幅減少[5]。因此，圖4顯示了流速對分離效率的影響。

隨著流量的增加，運行時間和峰寬進(jìn)一步減小。運行時間從大約 2.5 分鐘縮短至 2 分鐘以內(nèi)。根據(jù)樣品的不同，溫度和壓力對組分的分離和保留的選擇性有影響。因此，在 100 bar 和 150 bar 以及 40℃ 和 50℃ 范圍內(nèi)進(jìn)行了 4 次實驗（見圖5）?？梢钥闯?，溫度和壓力的變化對各自的分離沒有明顯的影響。因此，疊層進(jìn)樣時，溫度控制在 40℃，背壓調(diào)節(jié)器控制在 150 bar。

為了提高分離效率，增加 TSO 的濃度和進(jìn)樣量(150μL ~ 250 μL)（見圖6左上）。在這些條件下，基線分離仍然是可行的。圖6（右上和下）顯示了在與單次進(jìn)樣圖 6 左上相同的實驗條件下，疊層進(jìn)樣時間為 0.97min，即每 0.97 分鐘進(jìn)樣一次。在這種情況下，每次額外注入都節(jié)省了平衡時間，提高了產(chǎn)能。最終采用基于時間的方法收集餾分。每次進(jìn)樣的紫外信號都表明了該方法具有良好的再現(xiàn)性（圖6右上）。垂直線表示收集相應(yīng)餾分的時間窗口。

結(jié)論

在文中，使用 Sepmatix 8x SFC 儀器進(jìn)行以 TSO 為分析物的手性柱篩選，將最合適的手性色譜柱，轉(zhuǎn)移到 Sepiatec SFC-50 儀器進(jìn)行制備。每根手性柱對手性物質(zhì)的反應(yīng)都不同，這就是為什么在純化過程之前必須進(jìn)行篩選的原因，作為標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的 TSO 可以在許多不同的手性柱上分離。

隨后在 SFC-50 上放大，并利用制備柱對等度純化的方法進(jìn)行優(yōu)化。結(jié)果表明，改性劑的選擇、改性劑在流動相中的比例和流量對分離效果有較大影響。在這些特定條件下，溫度和壓力的變化對分離效果的影響不大。在一般情況下，這兩個參數(shù)也可以改變以優(yōu)化分離條件。

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