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            【瑞士步琦】【應(yīng)用】利用Pure C-850雙模式進(jìn)行辣椒素純化分離

            【瑞士步琦】【應(yīng)用】利用Pure C-850雙模式進(jìn)行辣椒素純化分離
            步琦  2024-04-15  |  閱讀:625

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            利用 Pure C-850 雙模式

            辣椒素純化分離

            Pure 應(yīng)用



            1



            介紹

            辣椒素主要來源于辣椒屬植物,不同種類的辣椒含有不同量的辣椒素,通常辣椒的辣度與其中辣椒素的含量有關(guān)。此外,一些其他植物也可能含有少量的辣椒素,例如胡椒、姜等。


             辣椒素結(jié)構(gòu)式


            辣椒素因其抗菌活性可用于生物膜和防污涂料,使其在食品包裝、食品保鮮、海洋環(huán)境和牙科治療等方面具有廣闊的應(yīng)用前景。辣椒素在代謝紊亂中也起著至關(guān)重要的作用,包括減肥、降壓和降低胰島素的作用。此外,辣椒素通過誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡和抑制腫瘤細(xì)胞的增殖,對(duì)預(yù)防肺癌、胃癌、結(jié)腸癌和乳腺癌等人類癌癥有效。先前的研究還表明辣椒素對(duì)緩解疼痛和認(rèn)知障礙有積極作用。辣椒素是瞬時(shí)受體電位香草素 1 型 (TRPV1) 的激動(dòng)劑,可選擇性激活 TRPV1,誘導(dǎo) Ca2+ 流入和相關(guān)的信號(hào)通路。最近,腸道菌群也參與了一些疾病的治療,但其對(duì)辣椒素作用的影響仍有待深入研究。


            在天然辣椒中同時(shí)存在辣椒素與二氫辣椒素,用硅膠柱層析或正相薄層色譜法(TLC)等傳統(tǒng)方法分離這兩個(gè)結(jié)構(gòu)相似的化合物十分困難。即使用中壓快速制備色譜(FLASH)分離純辣椒素也非常困難,因此往往需要使用中壓制備色譜法和高壓制備色譜法進(jìn)行兩步純化。在本次的應(yīng)用文章中,我們將會(huì)展示如何利用兩步分離從紅辣椒原料中提取 HPLC 峰面積達(dá) 95% 以上的辣椒素。


            2



            儀器、耗材與試劑

            儀器:

            • 步琦 Pure C-850 中高壓一體純化分離系統(tǒng)

            • 步琦 E-800 索氏萃取系統(tǒng)

            • Agilent 1260 Infinity II 液相色譜分析系統(tǒng)

             Pure C-850 制備色譜系統(tǒng)

            3.png

             E-800 索氏萃取系統(tǒng)


            耗材:

            • VisionHT C18 3μm, 150 x 4.6mm

            • FlashPure Ecoflex Silica 12g

            • BUCHI PrepPure C18 100 ?, 10 μm, 250 x 20 mm


            試劑與樣品:

            • 市售紅辣椒 10g

            • 去離子水 4L

            • 乙腈(HPLC 級(jí))4L

            • 甲醇(AR 級(jí))4L

            • 二氯甲烷(AR 級(jí))4L

            • 乙醇(AR 級(jí))1L

            • 辣椒素標(biāo)樣 99.5% 100mg


            3



            實(shí)驗(yàn)部分

            樣品準(zhǔn)備:

            將市售紅辣椒皮碾碎成粉狀,取 5g 置于 E-800 索氏提取器的萃取腔內(nèi),溶劑杯內(nèi)加入 100mL 乙醇,加熱等級(jí)設(shè)定為 13 級(jí),整個(gè)提取過程持續(xù) 4 小時(shí),制成辣椒皮萃取液。


            確認(rèn)辣椒素峰位置:

            HPLC 條件

            色譜柱

            VisionHT C18 3μm, 150 x 4.6mm

            流速

            1.5mL/min

            溶劑 A

            溶劑 B

            乙腈

            梯度

            50% 等度,6 分鐘

            紫外波長

            227nm


             辣椒素標(biāo)樣出峰圖


             辣椒皮萃取液出峰圖


            根據(jù)辣椒素標(biāo)樣,我們可以確定辣椒素的出峰位置為 3.884 min,通過這一參數(shù)我們可以確認(rèn)之后每一步分離的餾分位置。


            辣椒素粗分離:

            色譜條件(C-850 FLASH 模式)

            色譜柱

            FlashPure Ecoflex Silica 12g

            平衡時(shí)間

            6 分鐘

            流速

            10 mL/min

            溶劑 A

            二氯甲烷

            溶劑 B

            甲醇

            梯度

            10% 等度,40 分鐘

            紫外波長

            254nm; 227nm; 280nm

            檢測器靈敏度

            上樣量

            600mg 紅辣椒皮粉末

            上樣模式

            干法上樣


            將 600mg 紅辣椒皮粉末與 3g 硅膠拌勻,放入干法上樣柱內(nèi)進(jìn)行上樣,在 C-850 的中壓模式下進(jìn)行初步純化分離。


             C-850 中壓模式下分離紅辣椒皮內(nèi)的化合物


            根據(jù)之前 HPLC 上辣椒素的出峰位置,我們大致判定目標(biāo)化合物被收集在 9-11 管內(nèi),將這幾管餾分合并后濃縮,進(jìn)行 HPLC 檢測。


             9-11 管餾分并管后 HPLC 檢測圖


            通過 HPLC 分離后,可以看到除了 3.882 min 的辣椒素,在 5.365 min 還有一個(gè)化合物,這是與辣椒素結(jié)構(gòu)相似的二氫辣椒素。


             二氫辣椒素結(jié)構(gòu)式


            中壓模式下的色譜柱填料粒徑通常為 30-50μm,很難將辣椒素與二氫辣椒素拆分開,因此我們需要將 C-850 切換至高壓模式,利用粒徑更小的高壓不銹鋼色譜柱分離這兩個(gè)化合物。


            獲取高純度辣椒素:

            色譜條件(C-850 高壓模式)

            色譜柱

            BUCHI PrepPure C18 100 ?, 10 μm, 250 x 20 mm

            平衡時(shí)間

            10 分鐘

            流速

            15mL/min

            溶劑 A

            溶劑 B

            乙腈

            梯度

            50% 等度,45 分鐘

            紫外波長

            254nm; 227nm; 280nm

            檢測器靈敏度


            將之前獲取的 9-11 管餾分濃縮后,在 C-850 的高壓模式下進(jìn)行分離。


             樣品粗分后 9-11 管餾分高壓分離圖


            根據(jù)之前 HPLC 的出峰順序,我們可以推測 21-26 管餾分為辣椒素,31-33 管餾分為二氫辣椒素,取 21-26 管分別進(jìn)行 HPLC 檢測。


             高壓模式下 21-26 管餾分 HPLC 檢測圖


            4



            結(jié)論

            辣椒皮中含有多種化合物,僅通過柱層析色譜或中壓制備色譜很難獲得高純度的單一化合物。步琦 Pure C-850 純化分離系統(tǒng)支持中壓和高壓雙模式,一臺(tái)儀器就能完成大量樣品的中壓粗分富集與高壓高純度純化,分離天然產(chǎn)物時(shí)具有明顯的優(yōu)勢。在本次應(yīng)用中,通過中壓和高壓的兩次分離,最終 24 與 25 管餾分的峰面積能達(dá)到 95% 以上,可以進(jìn)行下一步的生物活性測試。





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