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概要

多劑量瓶(MDV)廣泛用于大多數(shù)生物制藥，在使用前會(huì)被抽取到塑料注射器中。然而，使用含有硅油的塑料注射器(SO注射器)處理治療性蛋白質(zhì)時(shí)形成的可分解顆?？赡艽嬖趩?wèn)題。本研究旨在評(píng)估含有人免疫球蛋白(IgG)和脂質(zhì)納米顆粒(LNPs)的MDV重新包裝注射器中微粒(>1 μm)形成和積累的程度和趨勢(shì)。采用光阻法(LO)和流動(dòng)成像(FI)對(duì)微粒進(jìn)行分析。使用SO注射器觀察到的微粒數(shù)量大于不含SO注射器，并且微粒數(shù)量隨著兩種藥物在注射器中重新包裝的次數(shù)不斷增加。然而，在不同品牌的SO注射器中觀察到很大的差異。相比之下，使用一種不同的技術(shù)從小瓶中提取藥物顯著減少了微粒的數(shù)量。此外，使用集成過(guò)濾針或在配方中加入穩(wěn)定劑如乙酰精氨酸和Tween 20也有助于減少顆粒的形成。

一、簡(jiǎn)介

多劑量瓶(mdv)比單劑量瓶(sdv)或預(yù)充注射器具有顯著的經(jīng)濟(jì)和后勤優(yōu)勢(shì)，特別是在大規(guī)模免疫規(guī)劃中。mdv是密封的容器，允許連續(xù)提取藥物部分而不改變殘留部分的質(zhì)量，包括純度、濃度和無(wú)菌。mdv被廣泛用于Covid- 19疫苗，包括Moderna和輝瑞的疫苗。然而，已經(jīng)報(bào)道了一些使用注射器將藥物從mdv中重新包裝的不良事件，如微生物污染、形成可見(jiàn)顆粒和導(dǎo)致免疫反應(yīng)。一項(xiàng)研究報(bào)道了使用mdv治療聚乙二醇肽可導(dǎo)致過(guò)敏反應(yīng)和死亡。對(duì)于可見(jiàn)微粒，MDV批次中觀察到的微粒數(shù)量(>1 μm)高于SDV批次，這表明過(guò)敏反應(yīng)與MDV中微粒的產(chǎn)生有關(guān)。

使用硅油注射器(SO注射器)可增加微粒的生成已被廣泛研究。研究表明，由于硅油的存在，亞可見(jiàn)顆粒的形成增加，而彈射或掉落注射器等機(jī)械應(yīng)力進(jìn)一步增加了顆粒的形成。硅油誘導(dǎo)的微?？墒够颊甙l(fā)生免疫原性反應(yīng)的風(fēng)險(xiǎn)較高。Chisholm等人(2016)的研究表明，蛋白質(zhì)吸附的硅油微粒破壞了對(duì)重組蛋白的免疫耐受和抗體反應(yīng)。其他幾項(xiàng)研究報(bào)告稱，在通過(guò)胰島素注射器進(jìn)行玻璃體內(nèi)注射后，患者的玻璃體腔中存在硅油滴(或飛蚊癥)，這促使美國(guó)視網(wǎng)膜專家協(xié)會(huì)發(fā)布了關(guān)于胰島素注射器中硅油滴的警報(bào)。預(yù)充注射器或針管產(chǎn)品可以替代塑料注射器。然而，據(jù)報(bào)道，主因是在包裝從小瓶切換到預(yù)充注射器的情況下形成了蛋白質(zhì)聚集。說(shuō)得更加具體的是蛋白質(zhì)暴露在某些產(chǎn)品中的硅油中，否則在小瓶中可能不會(huì)遇到。

圖1所示。圖示演示了從小瓶中提取藥物的常規(guī)逐步指導(dǎo)(稱為“來(lái)回運(yùn)動(dòng)”)

盡管有關(guān)于SO注射器不良反應(yīng)的報(bào)道，但在大多數(shù)臨床或非臨床環(huán)境中沒(méi)有采取緩解措施。此外，MDV的劑量大小為每瓶2至20劑，大多數(shù)兒童免疫接種為每瓶10或20劑，這可能會(huì)增加硅油從注射器滲入到小瓶的風(fēng)險(xiǎn)。一項(xiàng)研究報(bào)道，將貝伐珠單抗從小瓶重新包裝到SO注射器中導(dǎo)致藥物濃度下降10%，微米級(jí)蛋白顆粒(>1 μm)大幅增加，隨后患者眼壓升高。另一項(xiàng)來(lái)自復(fù)合藥房的重新包裝貝伐珠單抗樣本的研究表明，硅油是顆粒數(shù)量增加的病原體。因此，了解與使用mdv和SO注射器相關(guān)的風(fēng)險(xiǎn)至關(guān)重要。

考慮到這些問(wèn)題，本研究旨在量化由于使用SO注射器而在MDV中形成的亞可見(jiàn)顆粒及其積累趨勢(shì)。我們模仿了在臨床環(huán)境中從小瓶中取出藥物的技術(shù)，這些技術(shù)也在幾個(gè)指南中提供(圖1)。以肌內(nèi)γ-球蛋白(IgG)和空脂質(zhì)納米顆粒(LNPs)為模型藥物。每個(gè)小瓶中的樣品被重新包裝成8個(gè)不同品牌的注射器，而只研究了、第四、第七和第八支注射器。光阻法(LO)測(cè)定顆粒數(shù)。雖然LO通常用于計(jì)算亞可見(jiàn)顆粒，但它不能計(jì)算半透明顆粒，并且可能錯(cuò)誤標(biāo)記顆粒大小。因此，將流式成像(FI)技術(shù)與LO技術(shù)結(jié)合使用，以確定顆粒計(jì)數(shù)并區(qū)分顆粒的形態(tài)。通過(guò)FT-IR和評(píng)估其重量差來(lái)確認(rèn)硅油的存在。

二、材料與方法

2.1 材料和樣品制備

編號(hào):020A19001, Gamma Globulin)，由165 mg/mL人源IgG、22.5 mg/mL甘氨酸和5mg /mL氯化鈉組成，pH值為6.8，購(gòu)自GC Biopharma(京畿道，韓國(guó))。IgG用相同的緩沖液稀釋至10 mg/mL, LNP在pH 7.4的緩沖液中稀釋40倍。LNP載體(以下簡(jiǎn)稱LNP)由脂質(zhì)膽固醇、peg2000神經(jīng)酰胺、陽(yáng)離子脂質(zhì)和1,2-二硬脂酰- asn -甘油-3-磷酸膽堿(dsc)組成，由EnhancedBio Inc.(首爾，韓國(guó))提供。注射用水(WFI)購(gòu)自JW制藥公司(韓國(guó)首爾)，異丙醇(IPA)購(gòu)自大田化學(xué)金屬有限公司(韓國(guó)京畿道)。n - α-乙酰- l-精氨酸和Tween?20 Surfact-Amps?洗滌劑溶液(Tween 20)分別購(gòu)自Sigma-Aldrich (St. Louis, LO, USA)和Thermo Fisher Scientific (Cleveland, OH, USA)。

比較三種不同品牌的注射器:(1)kovax -注射器1 mL，可拆卸26號(hào)針頭(so -注射器1;韓國(guó)疫苗有限公司，京畿道，韓國(guó))，(2)b1ml帶Luer-lok?尖端的注射器(so -注射器2;Becton, Dickinson and Company, Franklin Lakes, NJ, USA)和(3)HENKE-JECT^?兩部分一次性注射器1ml不含硅油(SO-free注射器)。所有的注射器都在有效期內(nèi)使用過(guò)。KOVAX-NEEDLE 25G (25G針頭;除了“過(guò)濾器針頭測(cè)試”外，研究中所有3支注射器都使用了韓國(guó)疫苗有限公司(Korea Vaccine Co.，京畿道，Korea京畿道)，該測(cè)試使用了胰島素/結(jié)核菌素注射器(Ezfilter^?1ml, Donghwa C&M)的可拆卸18號(hào)針頭和5 μm針頭過(guò)濾器。(首爾，韓國(guó))。針頭從原來(lái)的注射器中分離出來(lái)使用。對(duì)于MDV，使用高壓滅菌后的5ml玻璃小瓶(BT134005, Hwankyung Tech, Seoul, Korea)，在重新包裝前用20mm橡膠塞和鋁壓蓋將其封閉。對(duì)于再包裝注射器，8支注射器從5 mL裝藥的小瓶中取出0.5 mL (n = 3)，第1、4、7、8支注射器用于顆粒分析。

圖2所示。(a)研究中使用的代表性塑料注射器和針頭，(b)使用WFI和IPA從每種類型的20支注射器中提取的干燥殘留物的重量，以及(c)從塑料注射器中提取的殘留物的疊加FT-IR光譜。

2.2 衰減全反射FT-IR光譜

使用Nicolet iS5分光光度計(jì)(Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA)配備iD5鉆石衰減全反射附件來(lái)鑒定硅油。在室溫下測(cè)量紅外光譜。為了從注射器中提取硅油，每種型號(hào)各取50支注射器，先充入0.5 mL的IPA，倒置10次，然后將內(nèi)容物釋放到50 mL的燒杯中。IPA在100°C下干燥，直到獲得恒定重量。提取物用100 μL異丙醇重溶。將制備好的樣品取5 μL置于結(jié)晶板上干燥5min，在4000 cm