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Understanding the effects of additives on therapeutic protein stability is of paramount importance for obtaining stable formulations. In this work, we apply several high- and medium-throughput methods to study the physical stability of a model monoclonal antibody at pH 5.0 and 6.5 in the presence of sucrose, arginine hydrochloride, and arginine glutamate. In low ionic strength buffer, the addition of salts reduces the antibody colloidal and thermal stability, attributed to screening of electrostatic interactions. The presence of glutamate ion in the arginine salt partially reduces the damaging effect of ionic strength increase. The addition of 280 mM sucrose shifts the thermal protein unfolding to a higher temperature. Arginine salts in the used concentration reduce the relative monomer yield after refolding from urea, whereas sucrose has a favorable effect on antibody refolding. In addition, we show 12-month long-term stability data and observe correlations between thermal protein stability, relative monomer yield after refolding, and monomer loss during storage. The monomer loss during storage is related to protein aggregation and formation of subvisible particles in some of the formulations. This study shows that the effect of commonly used additives on the long-term antibody physical stability can be predicted using orthogonal biophysical measurements.

了解添加劑對(duì)治療蛋白穩(wěn)定性的影響對(duì)于獲得穩(wěn)定的配方至關(guān)重要。在這項(xiàng)工作中，作者應(yīng)用了幾種高通量和中通量的方法來(lái)研究模型單克隆抗體在pH 5.0和6.5的條件下，蔗糖，鹽酸精氨酸和精氨酸谷氨酸存在的物理穩(wěn)定性。在低離子強(qiáng)度緩沖液中，鹽的加入降低了抗體的膠態(tài)和熱穩(wěn)定性，歸因于靜電相互作用的增加。精氨酸鹽中谷氨酸離子的存在部分降低了離子強(qiáng)度增加的損傷作用。添加280mM蔗糖后，熱蛋白的展開(kāi)溫度升高。使用濃度的精氨酸鹽降低了尿素重折疊后的相對(duì)單體產(chǎn)率，而蔗糖對(duì)抗體重折疊有較好的作用。此外，作者還展示了12個(gè)月的長(zhǎng)期穩(wěn)定性數(shù)據(jù)，并觀察了熱蛋白穩(wěn)定性、再折疊后的相對(duì)單體收率和單體在貯藏過(guò)程中的損失之間的相關(guān)性。貯存過(guò)程中單體的損失與某些配方中的蛋白質(zhì)聚集和亞可見(jiàn)顆粒的形成有關(guān)。本研究表明，常用添加劑對(duì)抗體長(zhǎng)期物理穩(wěn)定性的影響可以通過(guò)正交生物物理測(cè)量來(lái)預(yù)測(cè)。

本研究中使用的單克隆抗體PPI13是一種人源IgG1k，分子量為148.9 kDa，等電點(diǎn)約為9。在不久的將來(lái)，關(guān)于PPI13的初級(jí)蛋白序列和其他信息將在一個(gè)在線數(shù)據(jù)庫(kù)(https://pippi-data.kemi.dtu.dk/)中提供。PPI13以無(wú)表面活性劑的散裝溶液提供，蛋白質(zhì)濃度為43 g/L。采用尺寸排阻色譜(SEC)批量檢測(cè)PPI13的純度，顯示相對(duì)單體含量>97%。如前所述，在25C條件下，用廣泛透析交換緩沖液至10 mM組氨酸/組氨酸鹽酸鹽，pH分別為5.0、5.75和6.5采用Nanodrop 2000紫外分光光度計(jì)(Thermo Fisher Scientific, Wilmington, DE)測(cè)量PPI13在280 nm處的吸收，并用蛋白消光系數(shù)計(jì)算蛋白濃度。在組氨酸緩沖液中分別制備蔗糖、ArgHCl、ArgGlu、胍鹽酸鹽(GuHCl)和nacld4添加劑的原液，并將其添加到透析蛋白溶液中。所有化學(xué)品都是高純度等級(jí)的，并從Sigma Aldrich (Steinheim，德國(guó))、VWR International (Darmstadt，德國(guó))或Fisher Scientific (Schwerte，德國(guó))購(gòu)買(mǎi)。來(lái)自arium?系統(tǒng)(Sartorius Lab Instruments GmbH, Goettingen, Germany)的超純水用于制備所有溶液。

長(zhǎng)期穩(wěn)定實(shí)驗(yàn)

分別用緩沖液(或緩沖液加添加劑)中蛋白濃度為5 g/L的PPI13樣品經(jīng)過(guò)0.22 mmol醋酸纖維素過(guò)濾器的無(wú)菌過(guò)濾，無(wú)菌填充到DIN2R I型玻璃瓶(MGlas AG, Münnerstadt，德國(guó))，用氟rotec?涂層橡膠氯丁基塞壓接(West Pharmaceutical Services)。并儲(chǔ)存在4C和25C所需的時(shí)間。三個(gè)不同的小瓶被用來(lái)分析每個(gè)條件和時(shí)間

熱蛋白的PPI13在不同pH值(a)和添加劑對(duì)熱演變的影響在酸堿5.0 (d)和6.5 (g)的影響。溫度對(duì)表面的水力半徑Rh PPI13在不同pH值(b)和添加劑對(duì)Rh在加熱的影響酸堿5.0 (e)和6.5 (h),溫度對(duì)多余的散射效果不同pH (c)下的PPI13配方和添加劑對(duì)pH 5.0 (f)和pH 6.5 (i)加熱過(guò)程中過(guò)量散射的影響。在a、c、d、f、g和i中，數(shù)據(jù)點(diǎn)密度降低以提高清晰度。所有樣品中PPI13的濃度均為5 g/L。

PPI13在pH為5.0和6.5的10 mM組氨酸緩沖液中的穩(wěn)定性指示參數(shù)。數(shù)值為三次重復(fù)的平均值，誤差為標(biāo)準(zhǔn)差。

PPI13在pH 5.0 (a)和pH 6.5 (b)無(wú)添加劑(方形)、280 mM蔗糖(圓形)、140 mM ArgHCl(三角形上)和70 mM ArgGlu(三角形下)的情況下相互擴(kuò)散系數(shù)的濃度依賴性。數(shù)據(jù)是由三份副本疊加而成的。這些線與點(diǎn)呈線性擬合。

概述用SAXS獲得的結(jié)果:PPI13在pH 5.0 (a)和pH 6.5 (b)時(shí)的P(r)函數(shù)，pH 5.0 (c)和pH 6.5 (d)時(shí)的Dmax, pH 5.0 (e)和pH 6.5 (f)時(shí)的Mm。

蛋白質(zhì)添加劑飽和轉(zhuǎn)移放大因素(AFSTD)測(cè)量單個(gè)原子的各種添加劑添加到PPI13 pH值5.0(左列)和6.5(右列),蔗糖(a和b), ArgHCl (c和d)和ArgGlu (e和f)。圖下面的標(biāo)簽指定的單個(gè)原子AFSTD測(cè)量,插圖顯示了添加分子的化學(xué)結(jié)構(gòu)，用于原子的匹配標(biāo)記。

(a)   天然和折疊PPI13在10 mM組氨酸pH 5.0下的SEC色譜圖。在一個(gè)單獨(dú)的實(shí)驗(yàn)中，14.2分鐘的峰值被確定為二聚體，使用SEC耦合到多角度光散射(數(shù)據(jù)未顯示)。在pH 5.0 (b)和pH 6.5 (c)條件下，在不添加280 mM蔗糖、140 mM ArgHCl或70 mM ArgGlu的條件下，用9 M尿素重新折疊PPI13蛋白時(shí)，PPI13的相對(duì)單體產(chǎn)量和可溶性蛋白產(chǎn)量。b和c中的值為三次重復(fù)的平均值，誤差棒為標(biāo)準(zhǔn)差。

添加劑對(duì)貯存12個(gè)月后可溶PPI13的單體回收和損失的影響。(a) pH 5.0下存儲(chǔ)25C， (b) pH 6.5下存儲(chǔ)25C， (C) pH 5.0下存儲(chǔ)4C， (d) pH 6.5下存儲(chǔ)4C。

研究了pH和添加劑對(duì)PPI13在25C下儲(chǔ)存12個(gè)月的亞可見(jiàn)粒子的影響。

在這項(xiàng)研究中,我們采用正交高、中通量技術(shù)來(lái)探討280nM 蔗糖、140mMArgHCl和70mMArgGlu對(duì)一種名為PPI13的單克隆抗體的穩(wěn)定性的影響。我們?cè)诟鞣N參數(shù)之間找到了良好的一致性,表明在低離子強(qiáng)度條件下,蔗糖穩(wěn)定了蛋白質(zhì),而在這種濃度下的arginine鹽在pH 5.0和6.5之間降低了膠體蛋白的穩(wěn)定性。這種減少可以通過(guò)離子強(qiáng)度的增加和蛋白質(zhì)單體之間的靜電斥量來(lái)解釋,一旦arginine鹽的離子與蛋白質(zhì)的表面結(jié)合,就像我們的STD-NMR實(shí)驗(yàn)一樣。我們還進(jìn)行了長(zhǎng)期穩(wěn)定性研究,以驗(yàn)證快速生物物理表征的觀察。與長(zhǎng)期穩(wěn)定數(shù)據(jù)相比較的2個(gè)參數(shù)是第一個(gè)熱的變點(diǎn)點(diǎn)的溫度,在等溫還原后,相對(duì)單體產(chǎn)生的溫度。PPI13在較低溫度下展開(kāi)的配方,具有低膠體穩(wěn)定性,是在25攝氏度后12個(gè)月儲(chǔ)存后形成的大量可見(jiàn)顆粒的配方。我們的工作在兩個(gè)方面都很重要。首先,它表明了許多生物物理技術(shù)所表示的PPI13公式

低物理穩(wěn)定性也是長(zhǎng)期儲(chǔ)存中蛋白質(zhì)聚集的配方。第二,我們表明,arginine鹽是否會(huì)抑制或促進(jìn)聚合高度依賴于其他溶液參數(shù),如解決方案的起始離子強(qiáng)度。雖然精氨酸無(wú)疑能在短間隔疏水相互作用的配方中帶來(lái)好處(例如:在高蛋白濃度下,或者在有長(zhǎng)期靜電排斥的情況下,精氨酸鹽對(duì)蛋白質(zhì)膠體的穩(wěn)定性有一種有害的影響,在蛋白質(zhì)配方中,靜電斥力對(duì)抑制蛋白質(zhì)聚集至關(guān)重要。在低離子強(qiáng)度下的稀蛋白溶液中。