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1形態(tài)
通過(guò)光學(xué)顯微鏡、掃描電子顯微鏡（SEM）或者透射電子顯微鏡（TEM）觀(guān)察微球的形態(tài)，微球形態(tài)與結(jié)構(gòu)的不同對(duì)微球的載藥量以及釋放行為有顯著影響[1]。表面粗糙的微球易吸附藥物結(jié)晶，往往會(huì)導(dǎo)致高突釋。通過(guò)對(duì)微球形態(tài)的觀(guān)察，總結(jié)不同工藝處方對(duì)其形態(tài)的影響，同時(shí)優(yōu)化制備工藝及處方，還可以改善微球的釋放行為。
SEM是目前觀(guān)察微球形態(tài)使用最廣泛的方法，被用于表面及切面形態(tài)的觀(guān)察（見(jiàn)圖1）。TEM 分辨率高，圖像為二級(jí)結(jié)構(gòu)平面，適用于亞微球、納米球粒徑測(cè)定。此外還有原子力學(xué)顯微鏡(atomic force microscopy，AFM)可用于觀(guān)察微球形態(tài)，AFM 優(yōu)點(diǎn)之一是分辨率高，與 SEM 相比，不需要對(duì)樣品進(jìn)行金屬?lài)婂�，避免了噴鍍后�?duì)樣品的表面形態(tài)造成的破壞，并且AFM 允許在液態(tài)環(huán)境下觀(guān)測(cè)樣品，而 SEM 則不行。但是 AFM 缺點(diǎn)是觀(guān)察范圍窄，得到數(shù)據(jù)不具有統(tǒng)計(jì)性，適合單個(gè)粒子表面形態(tài)的觀(guān)察。
圖1 SEM觀(guān)察的PLGA-Glu微球圖像
(A)全視圖 (B)單個(gè)微球表面圖 (C)單個(gè)微球切面圖
2粒徑及分布
粒徑大小及其分布是影響微球制劑釋放行為的關(guān)鍵因素。粒徑測(cè)定的方法有多種，動(dòng)態(tài)光散射（DLS）、激光衍射法（LLD）、TEM、SEM、AFM等。粒徑的分布除了可用粒徑分布圖表示，還可用多分散性指數(shù)( polydispersity index，PDI) 和跨距表示[2]。跨距與多分散性指數(shù)數(shù)值越小，表示粒徑分布越均勻。
3載藥量/包封率
載藥量和包封率是反映微球制劑中藥物含量的重要指標(biāo)，載藥量的批間穩(wěn)定性是工藝成熟的重要標(biāo)志，也是衡量制備工藝和成本的重要指標(biāo)[3]。
載藥量和包封率的計(jì)算都需要建立在藥物含量測(cè)定的基礎(chǔ)上，目前上市的微球制劑所用載體多為聚乳酸-羥基乙酸共聚物(PLGA)。由于 PLGA 易溶于二氯甲烷、三氯甲烷、二甲亞砜等有機(jī)溶劑，而不溶于水、醇。依據(jù)藥物和 PLGA 的溶解性質(zhì)，PLGA 微球常用的含量測(cè)定方法有：
① 先用有機(jī)溶劑溶解 PLGA 和藥物，再用不溶于 PLGA 溶劑沉淀 PLGA，經(jīng)過(guò)離心或過(guò)濾后，取上清進(jìn)液相測(cè)定含量；
② 先用有機(jī)溶劑溶解 PLGA 和藥物，再加入醋酸鹽緩沖液等溶劑提取多肽后進(jìn)樣分析；
③ 溶劑溶解 PLGA 及藥物后，直接進(jìn)樣測(cè)定。
方法①和②需要在測(cè)定之前將高聚物與藥物分離，而且分離過(guò)程使用的試劑容易導(dǎo)致藥物損失。方法③的優(yōu)勢(shì)在于無(wú)需將高聚物與藥物分離，但是應(yīng)用較少，需要使用質(zhì)譜等特殊儀器。
4釋放行為、突釋效應(yīng)和滲漏率
1) 釋放行為
在載藥微球的研發(fā)階段，應(yīng)確定好合適的體外釋放條件，并根據(jù)體內(nèi)釋放條件建立體內(nèi)、體外相關(guān)性。對(duì)于釋放周期較長(zhǎng)的載藥微球，可以建立加快釋放試驗(yàn)的方法，預(yù)測(cè)模擬常規(guī)釋放行為[4]。建立加速釋放的條件要遵循相關(guān)性原則，使加速釋放曲線(xiàn)盡量擬合常規(guī)釋放曲線(xiàn)，得到準(zhǔn)確的相關(guān)性。
釋放行為是根據(jù)臨床適應(yīng)癥需求和高分子聚合物材料性質(zhì)共同決定的。選擇合適的高分子聚合物材料與工藝制備不同結(jié)構(gòu)的載藥微球，使活性成分按照預(yù)期的藥代動(dòng)力學(xué)模型釋放。對(duì)于可生物降解材料，溶脹和溶蝕機(jī)制也是控制藥物釋放的主要因素。釋放介質(zhì)的組成、pH 值、離子強(qiáng)度、滲透壓和溫度等都會(huì)對(duì)釋放速率產(chǎn)生影響。
2) 突釋效應(yīng)
在微球釋放的最初階段，吸附在微球表面的藥物會(huì)通過(guò)擴(kuò)散作用而快速釋放，稱(chēng)為突釋效應(yīng)[5]。突釋效應(yīng)可能導(dǎo)致人體內(nèi)藥物濃度在短時(shí)間內(nèi)迅速升高，并使得藥物效期縮短，是限制微球廣泛應(yīng)用的關(guān)鍵問(wèn)題，因此在質(zhì)量控制過(guò)程中必須重點(diǎn)關(guān)注突釋率這一指標(biāo)。目前主要通過(guò)體外釋放度實(shí)驗(yàn)考察微球的突釋效應(yīng)。
2020 版《中國(guó)藥典》明確規(guī)定載藥微球在前 0.5h 內(nèi)釋放的藥物含量要低于40%。緩釋微球制劑的體外釋放方法，目前并沒(méi)有統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)要求，目前報(bào)道的微球制劑體外釋放度測(cè)定方法主要有：
① 直接釋藥法，這是目前最常用的方法，包括搖床法和恒溫水浴靜態(tài)法。
② 流通池法，此法已被美國(guó)藥典收載，被廣泛應(yīng)用于緩釋制劑的研究。
③ 透析膜擴(kuò)散法，該法是指將微球放入透析管中，并將其放入介質(zhì)中測(cè)定。3種方法優(yōu)缺點(diǎn)比較見(jiàn)表1。
表1 微球制劑體外釋放度實(shí)驗(yàn)方法的比較
除了改進(jìn)體外釋放度的實(shí)驗(yàn)裝置，還可以通過(guò)調(diào)節(jié)釋放介質(zhì)溫度、pH值、離子強(qiáng)度、攪拌速率以及使用表面活性劑、酶等方式能實(shí)現(xiàn)微球體外加速釋放，而達(dá)到縮短檢驗(yàn)周期，提高檢驗(yàn)效率的目的。
3) 滲漏率
微粒制劑應(yīng)檢查滲漏率，可由下式計(jì)算：
滲漏率=產(chǎn)品在貯存一段時(shí)間后滲漏到介質(zhì)中的藥量/產(chǎn)品在貯存前包封的藥量×100%
5有關(guān)物質(zhì)和雜質(zhì)分析
鑒于已上市的產(chǎn)品大部分為多肽微球，其相關(guān)雜質(zhì)包括降解雜質(zhì)、工藝雜質(zhì)以及聚合物雜質(zhì)：
降解雜質(zhì)包括藥物在生產(chǎn)、儲(chǔ)存過(guò)程中發(fā)生水解、氧化反應(yīng)而生成的產(chǎn)物。
工藝雜質(zhì)中得到最廣泛關(guān)注的是乙�；s質(zhì)，這類(lèi)雜質(zhì)是由藥物多肽中的氨基、羥基與PLGA的羧基末端經(jīng)過(guò)化學(xué)反應(yīng)生成的，這種雜質(zhì)目前在PLGA微球中廣泛存在。乙酰化雜質(zhì)的產(chǎn)生與多肽自身結(jié)構(gòu)有關(guān)，質(zhì)譜和毛細(xì)管電泳技術(shù)聯(lián)合使用可用于其他多肽微球的乙酰化雜質(zhì)檢測(cè)。
聚合物雜質(zhì)包括多肽或蛋白自身相聚合形成的雜質(zhì)，以及聚合物-多肽雜質(zhì)。
6Zeta電位測(cè)定
Zeta電位也是微球的一個(gè)重要屬性，Zeta電位往往能指征微球制劑的穩(wěn)定性，而這一指標(biāo)卻容易被忽視。在微粒分散體系的溶液中，其表面帶有同種離子，通過(guò)靜電引力吸附和擴(kuò)散作用，在微粒周?chē)纬傻奈綄优c相鄰的擴(kuò)散層共同構(gòu)成微粒的雙電層結(jié)構(gòu)，從吸附層表面至反離子電荷為零處的電位差叫動(dòng)電位，即Zeta電位。Zeta電位值可以反映微粒的物理穩(wěn)定性，Zeta電位越大，微粒之間的排斥作用越強(qiáng)，絮凝或沉積的可能性越小，微粒在溶液中越穩(wěn)定。一般Zeta電位絕對(duì)值大于15mV，可以達(dá)到穩(wěn)定性要求。
7有機(jī)溶劑殘留
生產(chǎn)過(guò)程中引入的油相（有機(jī)溶劑）在固化的過(guò)程中會(huì)存在未能完全除去的問(wèn)題，如丙酮、乙酸乙酯、二氯甲烷等殘留，不僅影響微球儲(chǔ)存的穩(wěn)定性，還會(huì)在注射后引起人體的副作用，因此必須對(duì)其限度進(jìn)行控制。
殘留溶劑一般采用氣相色譜法來(lái)測(cè)定。此外，對(duì)于固體無(wú)菌粉末制劑，一般都要求控制水分的含量。由于微球制劑大都是多肽或蛋白類(lèi)藥物，這類(lèi)藥物對(duì)熱不穩(wěn)定，因此不適合采用干燥失重的方法測(cè)定水分，可以采用卡爾-費(fèi)休氏水分測(cè)定方法來(lái)完成。
8微生物檢查
微球制劑的細(xì)菌內(nèi)毒素和無(wú)菌檢查，需要進(jìn)行球內(nèi)和球外部檢測(cè)實(shí)驗(yàn)，一般凍干制劑要求更加嚴(yán)格。微球的粒徑遠(yuǎn)大于真菌和細(xì)菌，因此表面及內(nèi)部均存在污染可能。
微球外部實(shí)驗(yàn)，旨在檢測(cè)制劑完成生產(chǎn)灌裝入瓶中時(shí)的微生物和細(xì)菌內(nèi)毒素; 微球內(nèi)部實(shí)驗(yàn)，旨在檢測(cè)微球內(nèi)部包含的微生物和細(xì)菌內(nèi)毒素。
可采用直接接種法對(duì)利培酮微球內(nèi)部和外部進(jìn)行無(wú)菌檢查，在內(nèi)部無(wú)菌檢查過(guò)程中，先用2 mL 二甲基亞砜將微球溶解和破碎，將溶解后全部液體接種至20 mL 培養(yǎng)基中，運(yùn)用顯微鏡觀(guān)察溶解和培養(yǎng)過(guò)程[6]。
這種內(nèi)部檢查方法經(jīng)方法學(xué)驗(yàn)證表明各驗(yàn)證菌生長(zhǎng)情況良好，使用濃度小于10% 的二甲基亞砜不會(huì)影響微生物的生長(zhǎng)，可應(yīng)用于微球制劑的無(wú)菌檢查。
9載體輔料特性檢測(cè)
微球制劑的緩釋功能是通過(guò)載體輔料實(shí)現(xiàn)的，這些載體輔料通常無(wú)毒、可降解且具有良好生物相容性。最常用的微球關(guān)鍵輔料包括聚乳酸、聚羥基丁酸酯、聚乳酸-羥基乙酸共聚物等。此類(lèi)輔料的黏度、分子量及分布范圍、組成單體的比例、單體殘留量、酸值、及玻璃轉(zhuǎn)化溫度等指標(biāo)都會(huì)影響微球的釋放周期和釋放速度。
（中國(guó)粉體網(wǎng)編輯整理/青黎）
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